3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических
.pdfУ крыс инфузионное системное введение ротенона в течение недели вызывает билатеральное поражение стриатума и бледного шара, ДА нейродегенерацию в черной субстанции (с уменьшением количества нейронов на 30%). На уровне поведения действие ротенона проявляется в виде снижения количества вертикальных стоек, гипокинезии и даже в выраженной каталепсии [5].
Недостатком модели является низкая селективность действия препарата — ротенон способен поражать практически все органы животных, вызывая некроз и даже неопластические изменения, в связи с чем ряд симптомов, которые ранее относили к паркинсоноподобному действию препарата — олигокинезию, проблемы с инициацией движения, можно отнести к общему ухудшению самочувствия исследуемых животных. Другим недостатком ротенона является его низкая химическая стабильность. Для формирования экспериментального паркинсонизма требуется большой период хронического введения ротенона (от 1 недели до 3 месяцев). Так, при подкожном введении ротенон растворяют в растительном масле и вводят в дозе (2 мг/кг/день) в течение 4 недель.
Высоко воспроизводимой моделью ПС у крыс (возраст 12–14 месяцев) является системное введение ротенона в дозе 2,75 или 3 мг/кг/день/7 дней внутрибрюшинно в специально приготовленном растворе. У животных развивается брадикинезия, постуральная неусточивость и/или ригидность, которые отменяются введением апоморфином [2]. Готовят маточный раствор ротенона 50 в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО) и разбавляемый нейтральным триглицеридом Miglyol 812 N до достижения концентрации в 2,75 или 3,0 мг/мл ротенона в 98% Miglyol 812 N и 2% ДМСО. Раствор готовится 2–3 раза в течение недели, хранится в темноте, перед введением тщательно перемешивается. Раствор вводится в расчете 1 мл на 1 кг веса животного. Поведение животных изучают в 3, 6, и 9 дни эксперимента. Используют ряд тестов для выявления экстрапирамидных нарушений, а также тест апоморфиновой вертикализации. Апоморфин вводится в дозе 1 мг/кг подкожно, через 5 мин проводят оценку вертикальной активности, а через 10 мин — постуральной неустойчивости.
Также используется унилатеральное введение ротенона (12 μг в 0,5 μл димексида со скоростью 0,1 μл/мин.) в «medial forebrain bundle» по координатам (AP:+0,2; L:±1,8; DV: 8 мм) стереотаксического атласа.
Интранигральное однократное унилатеральное введение ротенона в малых дозах на сегодняшний день предлагается как одна из адекватных моделей ПС у крыс [19], которая воспроизводит длительные нейрохимические и нейропатологические изменения, схожие с изменениями при БП в нигростриатной системе. Применение данного способа введения ротенона (в дозах 3-, 6- и 12-мкг) не вызывает изменений в периферических органах на протяжении 4 недель наблюдения.
Ротенон, растворенный в ДМСО, вводят в компактную зону черной субстанции правого полушария по стереотаксическим координатам (AP: 5,0 мм; L: 2,0 мм; DV: 8,0 мм) со скоростью 0,2 мкл/мин, иглу выводят из мозговой ткани спустя 5 мин после введения.
В течение первых 72 ч после операции проводят наблюдения на наличие любой анормальной активности крыс, например, появление ротационных движений. Тест апорфиново-индуцированного вращения проводят через 2 недели после интранигрального введения ротенона еженедельно на протяжении 1,5 месяцев, а затем раз в месяц до достижения 6 месяцев, в зависимости от задач исследования. Апоморфин вводят в дозе 1,5 мг/кг и наблюдают за вращениями животного в течение 30 мин.
4.11. Модель L-дофа индуцированной дискинезии
Уже после 2–3 лет постоянного приема ДОФА-содержащих средств (ДСС) развиваются двигательные флюктуации и дискинезии более чем у 40% больных, риск появления которых увеличивается на 10% в год при продолжительной L-дофа терапии. Причинами двигательных флюктуаций являются: прогрессирующая, нарастающая с течением заболевания деге-
231
нерация нигростриарных нейронов, изменение функционального состояния и чувствительности дофаминергических рецепторов, колебание уровня леводопы в плазме, связанное с приемом ДСС, нарушение способности к захвату леводопы, синтезу из леводопы дофамина
инарушение депонирования дофамина и его высвобождения в синаптическую щель [15]. Факторами риска для появления L-дофа индуцируемых дискинезий (ЛИД) являются молодой возраст начала заболевания, продолжительность лечения и дозы леводопы, тяжесть
ипредставленность признаков БП и женский пол. Поиск препаратов для предупреждения и лечения этого серьезного осложнения является крайне актуальным.
Впоследние несколько десятилетий для исследования ЛИД активно используются гемипаркинсонические крысы [15]. В условиях этой модели БП крысы получают внутримозговую унилатеральную инъекцию 6-ГОДА, что вызывает ипсилатеральное разрушение ДА нейронов и вращение крыс в сторону, противоположную стороне поражения. После инъекции дофаминовых агонистов, таких как апоморфин и L-дофа наблюдается контралатеральное вращение, а в ответ на введение дофаминовых антагонистов — амфетамина — крысы вращаются в ипсилатеральном направлении. На основе данного факта построена модель дискинезии, вызванной хроническим введением L-дофа [1, 9].
Спустя 3 недели после введения 6-ГОДА крысам вводят L-дофа в терапевтической дозе 6–10 мг/кг внутрибрюшинно в течение 15 дней и бенсеразид (DL-serine 2-(2,3,4-trihydroxybenzyl) hydrazine hydrochloride) в дозе 15 мг/кг, подкожно, растворенный в физиологическом растворе с добавлением 0,1% аскорбиновой кислоты.
4.12. Оценка L-дофа индуцированной дискинезии по шкале аномальных непроизвольных движений
Шкала аномальных непроизвольных движений у крыс, вызванных ЛИД, включает стереотипные движения и контраверсивную ротацию [20]. Выделяют три типа стереотипий: дискинезия конечностей, осевая дискинезия и жевательная дискинезия. Дискинезия конечностей рассматривается как повторяющиеся миоклонические движения или дистонические положения передней конечности стороны противоположной поражению. Осевые дискинезии определяются как сгибания или осевое вращение шеи и туловища в направлении контралатеральном стороне поражения. Оролингвальная (орофациальная) дискинезия выражается в повторяющихся жевательных движениях челюсти, которые могут сопровождаться высовыванием языка. Ротационное поведение определяется как повороты или вращательные движения в направлении противоположном стороне введения 6-ГОДА. Оценка аномальных непроизвольных движений проводится в баллах и основана на их продолжительности: 0 — отсутствие аномальных движений; 1 — редкие аномальные движения, которые занимают меньше 50% времени наблюдения; 2 — частые аномальные движения, которые занимают 50% времени наблюдения; 3 — аномальные двигательные акты, происходящие непрерывно, но прерываемые сенсорными стимулами (например, постукивание по боксу); 4 — непрерывные, непрерываемые сенсорными стимулами аномальные двигательные акты.
За каждой крысой наблюдают в течение 1 мин на протяжении 140 мин через каждые 35 мин. Баллы, полученные при оценке разных видов стереотипий и ротационного движения крысы, суммируются. Вычисляется среднее значение по группе.
5. Сопутствующие нейропсихотропные эффекты противопаркинсонических лекарственных средств, побочное действие и острая токсичность
В дополнение к данным об основной противопаркинсонической активности следует представить данные о других эффектах препарата и острой токсичности. Учитывая спектр фармакологической активности известных препаратов, близких по структуре исследуемому, определяют наличие или отсутствие седативного или активирующего эффектов, влияние на обучение и память, агрессивность и другие возможные эффекты.
Для оценки седативного или активирующего действия регистрируют поведение в открытом поле и в актометрах любого типа, используют тест залезания на сетку; изучение
232
влияния на обучение и память можно провести в тестах пассивного и активного избегания: для изучения миорелаксантного действия используются тесты вращающегося стержня, рефлекса подтягивания на перекладине, тест бокового положения; для оценки агрессивности можно использовать провоцирующий «драку» электрический ток. Исследование дополнительных эффектов проводят в широком диапазоне доз.
Острая токсичность изучается на двух видах животных, на которых изучалась основная активность, при тех же путях введения. Рассчитывается ЛД50.
6. Изучение эффектов противопаркинсонических лекарственных средств при длительном введении и отмене
Учитывая, что лечение больных паркинсонизмом проводится длительными курсами, а также имеющиеся данные о снижении эффективности большинства известных противопаркинсонических препаратов при длительном применении, следует проводить оценку эффективности исследуемого вещества на нескольких базисных тестах при курсовом введении (не менее 1 мес.).
С целью оценки возможного синдрома отмены следует провести оценку основных показателей поведения и рефлексов животных после отмены длительного введения препарата (через 36–72 ч). Поскольку существует возможность усиления симптомов ПС на фоне резкой отмены препарата, целесообразно оценить реакцию животных по основным проявлениям ПС на основных моделях.
7. Исследование механизма действия противопаркинсонических лекарственных средств
Представляются данные по изучению механизма действия, имеющиеся на данный момент. Рекомендуются радиолигандные исследования, изучение сдвигов нейромедиаторного баланса, особенно ДА, АЦХ, серотонина.
8. Изучение взаимодействия противопаркинсонических лекарственных средств с другими препаратами
В связи с преобладанием заболеваемости паркинсонизмом среди людей пожилого возраста, имеющих, как правило, ряд сопутствующих заболеваний и принимающих другие препараты, рекомендуется оценить взаимодействие нового препарата с транквилизаторами, снотворными, а также с этанолом и, желательно, сердечно-сосудистыми препаратами.
9. Изучение общей фармакологической активности противопаркинсонических лекарственных средств, влияния на сердечно-сосудистую систему, дыхание
Наблюдение за состоянием животных осуществляют на мышах и крысах при введении препарата в широком диапазоне доз. При этом определяется повышение или снижение возбудимости, наличие судорог, гиперкинезов, изменение цвета кожных покровов, взъерошивание шерсти, птоз, стереотипия, груминг. Изучается пиннеальный, болевой, роговичный рефлексы, влияние на температуру тела, потребление воды и пищи. Влияние на ССС, дыхание и на периферические отделы нервной системы изучается на интактных или наркотизированных кошках, кроликах или крысах по влиянию на уровень кровяного давления, ритм сердечной деятельности, дыхания, а также на реакции, вызванные введением нейромедиаторов, например, адреналина, норадреналина, ацетилхолина, серотонина.
Заключение
В заключении кратко суммируются полученные данные о спектре противопаркинсонической активности, анализируются дополнительные и побочные эффекты, представляются сведения о преимуществах нового препарата перед известными средствами сходной направленности действия.
233
Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.
Литература
1.Bishop C., Taylor J.L., Kuhn D.M., Eskow K.L., Park J.Y., Walker P.D. MDMA and fenfluramine reduce L-DOPA-induced dyskinesia via indirect 5-HT1A receptor stimulation. 2006. Eur J Neurosci 23: 2669–2676.
2.Cannon J.R., Tapias V.M., Na H.M., Honick A.S., Drolet R.E., Greenamyre J.T. A highly reproducible rotenone model of Parkinson’s disease. Neurobiol Dis. 2009. 34(2): 279–290.
3.Colpaert F.C. Pharmacological characteristics of tremor, rigidity and hypokinesia induced by reserpine in rat. Neuropharmacology, 1987; 26(9): 1431–40.
4.Dutta G., Zhang P., Liu B.. The Lipopolysaccharide Parkinson’s disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundam Clin Pharmacol. 2008. 22(5): 453–464.
5.Fleming S.M., Salcedo J., Fernagut P.O., Rockenstein E., Masliah E., Levine M.S., Chesselet M.F. Early and Progressive Sensorimotor Anomalies in Mice Overexpressing Wild-Type Human α-Synuclein. J. Neurosci. 2004а. 24: 9434–9440.
6.Fleming S.M., Zhu C., Fernagut P.O., Mehta A., Dicarlo C.D., Seaman R.L., Chesselet M.F. Behavioral and immunohistochemical e ects of chronic intravenous and subcutaneous infusions of varying doses of rotenone. Exp Neurol. 2004b. 187(2):418–29.
7.Heikkila R.E., Cabbat F.S., Manzino L., Duvoisin R.C. E ects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6- tetrahydropyridine on neostriatal dopamine in mice. Neuropharmacology, 1984; 23(6): 711–3.
8.Kirik D., Rosenblad C., Bjorklund A. Preservation of a functional nigrostriatal dopamine pathway by GDNF in the intrastriatal 6-OHDA lesion model depends on the site of administration of the trophic factor. Eur J Neurosci, Nov 2000; 12(11): 3871–82.
9.Lindgren H.S., Rylander D., Ohlin K.E., Lundblad M., Cenci M.A. The «motor complication syndrome» in rats with 6-OHDA lesions treated chronically with L-DOPA: relation to dose and route of administration. 2007.Behav Brain Res 177:150–159.
10.Liu Y., Qin L., Wilson B., Wu X., Qian L., Granholm A.-C., Crews F.T., Honga J.-S. Endotoxin induces a delayed loss of TH-IR neurons in substantia nigra and motor behavioral deficits. Neurotoxicology. 2008. 29(5): 864–870.
11.Meredith G.E., Sonsalla P., Chesselet M.-F. Animal Models of Parkinson's Disease Progression. Acta Neuropathol. 2008; 115(4): 385–398.
12.Morpurgo C. Influence of phenothiazine derivatives on the accumulation of brain amines.
13.Ogawa №., Hirose Y., Ohara S., Ono T., Watanabe Y. A simple quantitative bradykinesia test in MPTP-treated mice. Res Commun Chem Pathol Pharmacol, 1985; 50(3): 435–41.
14.Putterman D.B., Munhall A.C., Kozell L.B., Belknap J.K., Johnson S.W.. Evaluation of levodopa dose and magnitude of dopamine depletion as risk factors for levodopa-induced dyskinesia in a rat model of Parkinson’s Disease’s. The journal of pharmacology and experimental therapeutics. 2007. Vol. 323, № 1: 277–284.
15.Sanberg P.R., Bunsey M.D., Giordano M., and Norman A.B. The catalepsy test: its ups and downs. Behav Neurosci, 1988; 102(5): 748–59.
16.Sonsalla P.K., Heikkila R.E. The influence of dose and dosing interval on MPTP-induced dopaminergic neurotoxicity in mice. Eur J Pharmacol. 1986; 129(3): 339–45.
17.Tillerson J.L., Miller G.W. Grid performance test to measure behavioral impairment in the MPTP- treated-mouse model of parkinsonism. J Neurosci Methods. 2003; 123(2): 189–200.
18.Xiong №., Huang J., Zhang Z., Xiong J., Liu X., Jia M., Wang F., Chen Ch., Cao X., Liang Z., Sun S. Stereotaxical Infusion of Rotenone: A Reliable Rodent Model for Parkinson's Disease. PLoS One. 2009; 4(11): e7878.
19.Winkler C., Kirik D., Bjorklund A., Cenci M.A. L-DOPA-induced dyskinesia in the intrastriatal 6-hydroxydopamine model of parkinson’s disease: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiol Dis, 2002; 10(2): 165–86.
ГЛАВА 14
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ ПРОТИВОСУДОРОЖНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Составители: д. м. н., проф. Т.А. Воронина; к. б. н. Л.Н. Неробкова
Введение
Эпилепсия представляет собой хроническое заболевание, характеризующееся повторными непровоцируемыми приступами нарушений двигательных, чувствительных, вегетативных, мыслительных или психических функций, возникающих вследствие чрезмерных нейронных разрядов в сером веществе коры головного мозга. Распространенность эпилепсии в популяции высока и достигает 0,5–0,75%, а среди детей — до 1% [3]. Диагноз эпилепсии основывается на регистрации моторных судорог и изменений электрической активности мозга (ЭЭГ). Эпилептические судороги представляют собой анормальные синхронизированные разряды, возникающие среди большой популяции нейронов. В зависимости от вовлекаемой нейрональной популяции могут возникать моторные, поведенческие нарушения, изменение сознания. Судороги являются однотипными для определенного больного, но очень существенно различаются между отдельными пациентами. Согласно Международной классификации эпилепсий, эпилептических синдромов и схожих заболеваний, принятой в 1989 г., эпилепсия не рассматривается как единое заболевание с различными приступами, а подразделяется на отдельные формы (эпилептические синдромы), имеющие свои электро-клинические особенности и различающиеся по прогнозу подходы к терапии. Эта классификация основана на классических представлениях о фокальных и генерализованных формах эпилепсии. Локальные формы эпилепсии диагностируются в том случае, если фокальный генез эпилептических приступов подтверждается данными ЭЭГ и методами нейровизуализации. В 2001 году комиссией ILAE был представлен новый проект классификации эпилепсий, согласно которой диагноз эпилепсии также ставится на основании анатомо-электро-клинических исследований [3].
Согласно симптоматической классификации судороги разделяют на парциальные (фокальные) и генерализованные. Парциальные судороги подразделяются на простые парциальные судороги с сохранным сознанием и комплексные парциальные судороги с нарушением сознания, когда пациент полностью не осознает окружающее; парциальные судороги могут переходить во вторично генерализованные с тонико-клоническими судорогами. Генерализованные судороги подразделяются на состояния, протекающие только с потерей сознания (абсансы) и с нарушением моторной активности (миоклонус, клонус, тонические, клонические, атонические судороги). Атонические и клонико-тонические судороги сопровождаются потерей сознания. Эпилептический статус характеризуется тем, что судорожные припадки следуют один за другим без восстановления сознания.
На основании анализа механизмов возникновения парциальных и вторично-генерализо- ванных приступов была сформулирована концепция о корковом эпилептогенном очаге, играющем роль «водителя ритма». Показано, что гиперсинхронный разряд из первичного эпилептогенного очага распространяется на другие определенные участки мозга за счет чего формируется динамичная эпилептическая система с образованием вторичных эпилептогенных очагов, которые в свою очередь приобретают детерминантные свойства [1, 3, 6, 11].
235
Современные противоэпилептические препараты включают вещества различных классов химических соединений и механизма действия, многие из которых известны довольно давно: фенобарбитал (1912 г.), фенитоин (1938 г.), этосукcимид (1958 г.), клоназепам (1964 г.), карбамазепин (1967 г.), оксикарбамазепин, препараты вальпроевой кислоты (1974 г.), вигабатрин (1989 г.), ламотриджин (1991 г.), габапентин (1993 г.), топирамат (1995 г.), тиагабин (1996 г.), леватирацетам, фелбамат и др. Классификации противоэпилептических препаратов представлены в обзорах и книгах [2, 16, 39]. Несмотря на имеющееся структурное сходство — химическая структура фенобарбитала послужила основой для создания препаратов из классов гидантоина (фенитоин), сукcинимида (этосукцимид) и оксазолидина (триметадион), — эти вещества обладают различными противосудорожными эффектами. Фенобарбитал и фенитоин эффективны при подавлении генерализованных тонико-клонических судорог и простых комплексных парциальных судорог, тогда как этосукцимид эффективен в подавлении абсансов. Различны и основные механизмы их действия — фенитоин блокирует вольтаж-зависимые натриевые каналы, а этосуксимид блокирует кальциевые-Т каналы. Появившиеся в 80-е годы противоэпилептические препараты нового поколения составили альтернативу препаратам первого поколения у 25% пациентов. В настоящее время наиболее широко применяемыми препаратами являются вальпроаты, фенитоин, карбамазепин. Эти препараты при изучении в эксперименте новых противосудорожных веществ следует в первую очередь использовать как эталонные.
Поиск новых противоэпилептических препаратов, в том числе и нового поколения, ведется прежде всего на основе оптимизации структур известных препаратов, изучения взаимосвязи структура–активность, что позволяет усилить противосудорожную активность, снизить побочные эффекты и улучшить нейропротекторные свойства. Другая стратегия включает изыскание новых препаратов на основе представлений о механизмах действия известных средств, что приводит к открытию мишеней, возможно и не вовлекаемых в эпилепсию, но участвующих в реализации действия противоэпилептических веществ. На настоящий момент наиболее продуктивной стратегией изыскания новых противоэпилептических веществ принято считать программу, включающую различные элементы обозначенных выше подходов.
При создании новых препаратов с противоэпилептической активностью необходимо также представлять, к какому типу судорог будет тропно действие будущего препарата в клинике, и на основании этого строить стратегию экспериментального изучения нового соединения.
1. Методики скрининга противоэпилептических веществ
Впервые батарея методов для изучения противоэпилептических веществ в эксперименте была предложена Goodman [22] и Swinyard [35]. Первое место в предложенной ими стратегии занимали методики максимального электрошока и антагонизма с пентелентетразолом (коразолом), которые и до настоящего времени остаются основными моделями в первичных скрининговых исследованиях противоэпилептических препаратов. За рубежом наиболее часто для оценки противоэпилептических веществ в эксперименте используется (с различными модификациями) программа, разработанная в США, — ADDP (Antiepileptic Drug Development Program).
Настоящие Методические рекомендации по экспериментальному изучению веществ с потенциальной противоэпилептической активностью основываются на обозначенных выше подходах к поиску современных противоэпилептических препаратов с учетом их механизма действия и имеющихся представлений о патогенезе эпилепсии и ее проявлениях в клинике.
Первый этап выявления потенциальных противоэпилептических препаратов состоит в оценке противосудорожных свойств веществ в скрининговых исследованиях на моделях первично-генерализованной эпилепсии, включающих судороги, вызванные электри-
236
ческим (тест максимального электрошока) и химическим воздействием (тест антагонизма с коразолом) у мышей и крыс [1, 11, 26, 28, 31].
Программа исследования включает несколько последовательных фаз.
Выявление противосудорожной активности и определение ее уровня по величинам ЭД50 (эффективная доза, оказывающая противосудорожный эффект у 50% животных). Исследования проводятся на мышах с использованием внутрибрюшинного введения вещества по тестам максимального электрошока (МЭШ) и антагонизма с коразолом (подкожное введение).
Определение уровня неврологического дефицита по величинам ТД50 (доза, вызывающая нейротоксический эффект у 50% животных) по тесту вращающегося стержня в исследованиях на мышах при внутрибрюшинном введении вещества. Вычисление терапевтической широты действия соединения по показателям ТД50/ЭД50.
Определение острой токсичности вещества (ЛД50) у мышей при внутрибрюшинном введении.
Определение активности соединения при введении внутрь мышам по тестам максимального электрошока (МЭШ), антагонизма с коразолом (подкожное введение) и вращающегося стержня.
Определение противосудорожной активности соединения при введении внутрь у другого вида животных — крыс — по тесту антагонизма с коразолом.
Сравнение активности нового соединения с активностью известных противосудорожных средств по тестам максимального электрошока (МЭШ), антагонизма с коразолом (подкожное введение) и вращающегося стержня.
Выбор для первой стадии скрининга противосудорожных веществ именно тестов максимального электрошока (МЭШ) и антагонизма с коразолом (подкожное введение) обусловлен качественным различием в развитии и проявлении этих судорожных припадков [35, 43]. Принято считать, что судороги, вызываемые МЭШ, моделируют «большие, Grant mal» судорожные припадки, а судороги, вызываемые подкожным введением коразола — «малые, petit mal» припадки. Эти тесты являются обязательными и в программе ADDP. Основной компонентой судорог при МЭШ является тоническая экстензия задних конечностей, и ее устранение вызывает фенитоин, карбамазепин, но не бензодиазепины и триметадион. Основной компонентой коразоловых судорог являются клонические судороги и их устраняют бензодиазепины, триметадион, вальпроат, но на них оказывает слабое действие фенитоин.
1.1. Тест максимального электрошока ( МЭШ)
Эксперименты проводятся на мышах и крысах. Животные получают через корнеальные или пиннеальные электроды электрические стимулы (50 Hz, 50 mA для мышей и 50 Hz, 150 mA для крыс), длительностью 0,2 с. Используемый показатель — максимальная тоническая экстензия задних конечностей, которая возникает у 100% контрольных животных. Оценивается способность исследуемого вещества предупреждать развитие тонической экстензии при его введении внутрибрюшинно или внутрь перед проведением МЭШ. Для определения ЭД50 — эффективной дозы вещества, оказывающей противосудорожный эффект у 50% животных, используется по меньшей мере 3 дозы вещества, и каждая доза испытывается на 8–10 животных. В качестве препаратов сравнения рекомендуется использовать фенитоин, карбамазепин и вальпроат.
1.2. Судороги, вызванные коразолом при его подкожном введении
Исследования проводят на беспородных белых мышах-самцах или мышах Crl:NMRI BR) массой 19–29 г. Каждая доза испытывается на 10 животных. Коразол вводится подкожно в область шейного отдела спины. В связи с высокой гигроскопичностью коразола и нестабильностью действующей дозы на первом этапе исследования определяется кривая зависимости доза–эффект для коразола. Животные наблюдаются в течение 30–60 мин
237
после инъекции коразола с регистрацией основного показателя — первых генерализованных клонических судорог с утратой рефлекса переворачивания. На основе этих данных расчитывается методом пробит-анализа (Litchfield, Wilcoxon) доза, вызывающая судороги у 97% животных (СД97). Эта доза может колебаться в зависимости от качества коразола от 50 до 120 мг/кг. После введения дозы СД97 у всех контрольных животных развиваются судорожные проявления в следующей последовательности. 1. Одно или более миоклонических подергиваний всего тела. 2. Повторяющиеся клонические судороги передних и/или задних конечностей длительностью более чем 3 с без потери рефлекса переворачивания. 3. Генерализованные клонические судороги передних и задних конечностей с утратой рефлекса переворачивания. 4. Тоническая экстензия передних конечностей с потерей рефлекса переворачивания. 5. Тоническая экстензия передних и задних конечностей с утратой рефлекса переворачивания. У 90–100% контрольных животных после введения коразола обязательно должны наблюдаться судорожные проявления, описанные в пунктах 1–3. Для определения противосудорожной активности нового исследуемого соединения коразол вводят после соединения на пике его максимального эффекта и затем осуществляют регистрацию судорог в течение 30– 60 мин. Животные, у которых не наблюдаются после введения вещества и затем коразола судороги в течение 30 мин, описанные в пункте 2 — повторяющиеся клонические судороги передних и/или задних конечностей длительностью более чем 3 с без потери рефлекса переворачивания или судороги последующих 3–5 стадий — рассматриваются как защищенные. Исследуется несколько доз соединения и на основании полученных данных методом пробит-анализа расчитывается ЭД50 и 95% доверительные интервалы (Litchfield, Wilcoxon).
1.3. Оценка нейротоксичности (ухудшение моторной функции)
Нейротоксичность у мышей и крыс прежде всего оценивается по нарушению координации движений по тесту вращающегося стержня. Неспособность животных удерживаться на вращающемся стержне в течение 1 мин, хотя бы один раз из 3-х попыток, учитывается как показатель нарушения этой функции. Для мышей, как правило, используется стержень диаметром 2,5 см и скоростью вращения 6 оборотов в минуту, а для крыс — диаметром 6 см и скоростью вращения 8 оборотов в минуту. Контрольные мыши удерживаются на вращающемся стержне по несколько минут, тогда как крысы требуют нескольких посадок на стержень. Исследуется несколько доз нового соединения и затем методом пробит-анализа расчитывается ТД50 (доза, оказывающая нейротоксическое действие у 50% животных) и 95% доверительные интервалы (Litchfield, Wilcoxon). Кроме того, возможно визуальное наблюдение за животными (крысы) с регистрацией нарушения походки, поз, мышечного тонуса.
1.4. Острая токсичность соединений
Острая токсичность изучается на двух видах животных, на которых проводилось исследование противосудорожной активности, при внутрибрюшинном и пероральном путях введения. Животные помещаются в индивидуальные клетки со свободным доступом к воде и пище. Регистрация гибели животных осуществляется через 24 ч после введения вещества. Вещество вводится не менее чем в 3–4 дозах. На основании полученных результатов рассчитывается ЛД50 (Litchfield, Wilcoxon).
2.Методики судорог, используемые для изучения спектра противосудорожных эффектов исследуемых веществ
Взависимости от результатов исследования, полученных в скрининге, проводится более углубленное изучение действия новых веществ. Методы для дальнейшего изучения подбираются в зависимости от спектра противосудорожных эффектов изучаемого препарата.
238
2.1.Методики, моделирующие первично-генерализованные судороги
2.1.1.Судороги, вызванные пикротоксином при его подкожном введении
Исследования проводят на беспородных белых мышах-самцах или мышах Crl:NMRI
BR) массой 19–29 г. Каждая доза испытывается на 10 животных. Пикротоксин вводится в дозе, вызывающей судороги у 97% животных (обычно доза 2,5 мг/кг), подкожно в область шейного отдела спины. Животные наблюдаются в течение 30–60 мин после инъекции пикротоксина. Соединение, с учетом пика его максимального эффекта, вводится до введения пикротоксина. В качестве критерия оценки противосудорожного действия нового вещества используется его способность подавлять развитие повторяющихся клонических судорог передних и/или задних конечностей длительностью более чем 3 с без потери рефлекса переворачивания. Исследуется несколько доз исследуемого соединения и на основании полученных данных методом пробит-анализа расчитываются ЭД50 и 95% доверительные интервалы (Litchfield, Wilcoxon).
2.1.2. Судороги, вызванные бикукуллином при его подкожном введении
Исследования проводят на беспородных белых мышах-самцах или мышах Crl:NMRI BR) массой 19–29 г. Каждая доза испытывается на 10 животных. Бикукуллин вводится в
дозе, вызывающей судороги у 97% животных (обычно доза 2,7 мг/кг), подкожно в область шейного отдела спины. Животные наблюдаются в течение 30–60 мин после инъекции бикукуллина. Исследуемое соединение вводится, с учетом пика его максимального эффекта, до введения бикукуллина. В качестве критерия оценки противосудорожного действия нового вещества используется его способность подавлять развитие вызываемых бикукуллином повторяющихся клонических судорог передних и/или задних конечностей длительностью более чем 3 с без потери рефлекса переворачивания. Исследуется несколько доз исследуемого соединения и на основании полученных данных методом пробит-анализа расчитываются ЭД50 и 95% доверительные интервалы (Litchfield, Wilcoxon).
2.1.3. Судороги, вызванные стрихнином при его подкожном введении
Исследования проводят на беспородных белых мышах-самцах или мышах Crl:NMRI BR) массой 19–29 г. Каждая доза испытывается на 10 животных. Стрихнин вводится в
дозе, вызывающей судороги у 97% животных (обычно доза 1,2 мг/кг), подкожно в область шейного отдела спины. Животные наблюдаются в течение 30–60 мин после инъекции стрихнина. Исследуемое соединение вводится, с учетом пика его максимального эффекта, до введения стрихнина. В качестве критерия оценки противосудорожного действия нового вещества используется его способность подавлять развитие тонических судорог, вызываемых стрихнином. Исследуется несколько доз нового соединения и на основании полученных данных методом пробит-анализа расчитываются ЭД50 и 95% доверительные интервалы (Litchfield, Wilcoxon).
2.1.4. Судороги, вызванные тиосемикарбазидом
Антагонизм с тиосемикарбазидом оценивается в исследованиях на мышах по способности исследуемых веществ предупреждать развитие судорог у животных. Оценку противосудорожного эффекта проводят по изменению латентного времени первого судорожного приступа, по наличию судорог и гибели животных. Тиосемикарбазид, как правило, в дозе 28 мг/кг (ЭД97 — доза, вызывающая судороги и гибель у 97% животных), вводят внутрибрюшинно через 10–40 мин после введения исследуемого вещества. «Защищенными» считают животных, которые выживают в течение 90 мин после введения тиосемикарбазида.
2.1.5. Судороги, вызванные камфорой
Исследования проводятся на белых беспородных мышах-самцах массой 20–24 г. Камфора вводится в дозе 1 г/кг подкожно или внутрибрюшинно в масляном растворе.
239
Исследуемое вещество вводится до введения камфоры и затем регистрируется его способностью ослаблять выраженность судорог и выживаемость животных. Рассчитываются показатели ЭД50.
2.1.6. Судороги, вызванные N-метил-D-аспартатом (NMDA) или квисквалатом
Исследования проводят на беспородных белых мышах-самцах или мышах Crl:NMRI BR) массой 19–29 г. Каждая доза испытывается на 10 животных. NMDA или квисквалат вводят в желудочки мозга. В низких дозах NMDA или квисквалат вызывают интенсивные эпизоды клонических судорог, а при увеличении дозы примерно в 10 раз в картине судорог преобладает тоническая экстензия передних конечностей. Дозы, вызывающие эти судороги у 97% животных, могут варьировать. Наиболее часто для NMDA и квисквалата они составляют 0,2 мг/5мл для клонических судорог и 3 мг/5мл для тонических судорог. Животные наблюдаются в течение 30 мин после инъекции NMDA или квисквалата. Исследуемое соединение вводится, с учетом пика его максимального эффекта, до введения NMDA или квисквалата. В качестве критерия оценки противосудорожного действия нового вещества используется его способность подавлять развитие клонических и тонических судорог, вызываемых NMDA или квисквалатом. Исследуется несколько доз нового соединения и на основании полученных данных методом пробит-анализа расчитываются ЭД50 и 95% доверительные интервалы (Litchfield, Wilcoxon). Подробно методика описана в [34,36].
2.1.7. Методика определения судорожного порога для судорог, вызванных коразолом
Коразол (0,1% раствор) вводится (титруется) внутривенно в хвостовую вену мышей со скоростью 0,3 мл/мин (желательно использовать инфузионный насос). У контрольных животных при такой инфузии появляются следующие типы судорог. 1. Одно или более миоклонических подергиваний всего тела. 2. Повторяющиеся клонические судороги передних и/или задних конечностей длительностью более чем 3 с без потери рефлекса переворачивания. 3. Генерализованные клонические судороги (клонус) передних и задних конечностей с утратой рефлекса переворачивания. 4. Клонические судороги, за которыми следует тоническая экстензия передних конечностей с потерей рефлекса переворачивания. 5. Тоническая экстензия задних конечностей с утратой рефлекса переворачивания (наблюдается не всегда, поскольку часто животные погибают раньше развития этой стадии).
В качестве критерия оценки противосудорожного действия нового вещества наиболее часто используется его способность предупреждать развитие 1, 3 и 4-й стадий судорог. Чтобы определить пороги судорожной реакции для различных стадий используются группы животных по 10–12 мышей для каждой дозы. Исследуемое вещество вводится внутрибрюшинно, и затем через определенный интервал времени, с учетом пика действия вещества, начинается титрование коразолом. Эффект вещества учитывается отдельно для каждой стадии как процент увеличения количества коразола, необходимого для получения судорог, характерных для этой стадии. Рассчитывается значимость различий в дозах коразола, требуемых для получения судорог у контрольных и получавших ЛС животных, обычно используя Student’s t-тест. В случае получения статистически значимых эффектов по этим данным рассчитывается показатель TID50 (threshold increasing dose) — доза увеличивающая порог судорог к коразолу на 50%, как правило, методом логарифмической линейной регрессии.
2.1.8. Методика киндлинга, вызванного введением коразола
Фармакологический киндлинг моделируется в исследованиях на мышах и крысах путем повторных введений коразола в дозе, не вызывающей судорожных состояний [6].
240