![](/user_photo/2706_HbeT2.jpg)
Гистология Klinicheskaya_embriologia_chitala_O_V_Shurygina
.docxКлиническая эмбриология
(19 ноября 2013 года. Лектор: Шурыгина О.В.)
Эмбриология изучает развитие зародыша от момента оплодотворения до рождения, а также процессы прогенеза – образование мужской и женской половых клеток.
Медицинская эмбриология изучает закономерности эмбрионального развития человека, причины нарушений и возникновения уродств, а также пути и способы влияния на эмбриогенез.
Почему происходит изменение в развитии?
Почему из одной клетки развивается многоклеточный организм?
Что определяет ход развития?
Какие факторы предопределяют и влияют на развитие человека?
Какие современные методы клеточной биологии помогают в решении проблем здоровья человека?
-
1677г. А. Leeuwenhoek с помощью сконструированного им микроскопа впервые исследовал сперму человека и не только обнаружил в ней «живчиков, зверьков» («анималькули»)-сперматозоиды, но и связал с ними акт зачатия. Анималь-
Кулисты (Г.Лейбниц,
А.Левенгук)
-
1795 г. J. Hunter впервые осуществил искусственную инсеминацию, введя во влагалище женщины эякулят ее мужа.
Отечественная эмбриология
-
К.М.Бэр – создал учение о зародышевых листках, из которых развиваются все ткани и органы. Он доказал, что человек развивается по тому же плану, что и все позвоночные
-
Был первым, кто изучил яйцеклетку под микроскопом
-
Дарственная медаль Академии наук «Начав с яйца, он показал человеку человека»
-
1827 г.- К.Е. Von Baer впервые описал яйцеклетки млекопитающего. Овисты (М.Мальпиги, Ш.Бонне).
-
1880 г. S.L. Schenk- первая попытка оплодотворения in vitro у млекопитающих.
-
1891 г. W. Heape осуществил успешную трансплантацию (перенос эмбриона) от одной самки кролика другой с последующим рождением потомства.
-
1897 г.- В.С. Груздев опубликовал статью, посвященную исследованиям по оплодотворению извлеченных из фолликулов крольчихи яйцеклеток, которые он затем во взвеси со спермой переносил в яйцевод животного.
-
1926-1929 г.- В. Zondek. Открытие гонадотропной функции гипофиза.
-
1932 г.- Вышел в свет роман А. Huxley «прекрасный новый мир» в котором был описан метод ЭКО.
-
1934г.- О.В. Красовская сообщила об оплодотворении яйцеклеток кролика in vitro.
1952г. – В результате обследования 49000 фертильных мужчин разработаны критерии оценки фертильности спермы
-
1955-1959г. Петров Г.Н. – первые исследования оплодотворения яйцеклетки вне организма.
-
1966г.- R.G.Edwards установил, что созревание женских яйцеклеток in vitro происходит в течение 36-37 часов после пика ЛГ.
-
1968г. – Начало совместной работы эмбриолога R.G. Edwards с гинекологом P.C. Streptoe
-
2010г .Нобелевская премия за
достижения в развитии ВРТ
(R.G. Edwards)
-
1975г.-R.G. Edwards и P.C. Streptoe получили первую беременность после ЭКО.
-
1978г- Рождение
первого в мире
«ребенка из
пробирки»
Луизы Браун.
25 июля 1978 года, Кембриджский Университет Великобритания
- рождение первого «ребенка из пробирки»
-
1983г.- Первые роды после переноса размороженных эмбрионов, полученных in vitro.
-
1984г.- Впервые произведена пункция и получение ооциов из яичников под УЗИ контролем
-
Начало проведение процедуры ЭКО с использованием индукции суперовуляции
-
1986г.-Рождение первых детей из пробирки в СССР (Е.А.Калинина, Л.В. Хилькевич)
-
2007 г. – естественное зачатие и рождение «первого внука ЭКО» (Россия)
-
1994г.-Первые сообщения о беременностях после ИКСИ с
использованием сперматозоидов,
полученных в результате пункции
яичка или его придатка
-
2002г.- Родился 1000000 ребенок «из пробирки»
-
2007г. – Родился 3000000 ребенок «из пробирки»
-
2010 г. – более 5 млн. детей «из пробирки»
-
В России ежегодно рождается около 8,3 тыс. детей
Коэффициент фертильности снижается в Европе. Становится Ниже Коэффициента Воспроизводства Населения
Снижение фертильности с возрастом неразрывно связано с овариальным резервом.
Частота встречаемости хромосомных аномалий плода возрастает с увеличением материнского возраста.
Этапы эмбрионального развития
-
Начальный (до 7 дн.)
-
Зародышевый (до 8 нед.)
-
Плодный (после 8 нед.)
Основные стадии эмбриогенеза:
1.Оплодотворение
2. Дробление
3. Гаструляция
4. Гистогенез, органогенез, системогенез
Яйцеклетка (100-200 мкм) Снаружи окружена фолликулярными клетками. Имеет 3 оболочки: оволемма, блестящая зона, лучистый венец. Хорошо развиты мтх, в цистернах ЭПС – кальциевые депо. Желток представлен в виде желточных гранул, его запаса хватает на 24 часа автономного существования яйцеклетки.
На цитомембране яйцеклетки есть рецепторы для сперматозоидов. Яйцеклетка человека имеет 2 дополнительные оболочки: блестящую оболочку, состоящую из гликозамингликанов, и лучистый венец (zona pellucida; corona radiata), образованный из фолликулярных клеток, которые прилипают к яйцеклетке пока она находится в фолликуле яичника.
Сперматозоид 65-67 мкм
Состоит из головки, шейки и хвоста. В головке - ядро с конденсированным неактивным хроматином. Верхнюю часть головки занимает акросома, содержащая несколько десятков ферментов, которые активизируются в ходе акросомальной реакции и обеспечивают проникновение сперматозоида через все оболочки яйцеклетки.
Хвост, длиной до 60 мкм. В нижней части шейки сперматозоида локализована центриоль, именно она обеспечивает возможность дробления оплодотворенной яйцеклетки.
В среднем отделе компактно, по окружности хвоста, располагаются митохондрии – источник энергии, необходимой для двигательной активности.
Гипоталамо-гипофизарная связь
В средней части гипоталамуса располагаются аркуатное и вентромедиальные ядра. Нейросекреторные ядра клетки этих ядер синтезируют 2 группы аденогипофизтроных гормонов: . Либерины - 6 различных лабиринов, соответственно для 6 видов клеток передней и промежуточной доли гипофиза ( усиливают функцию клеток этих долей гипофиза). . Статины - тоже 6 разновидностей - тормозят работу (снижают функции) клеток передней и промежуточной доли гипофиза.
Гормональная регуляция
-
ФСГ – выработка сперматозоидов в семенных канальцах, воздействует на клетки Сертоли (выработка ингибина), стимулирует выработку тестостерона в клетках Лейдига (тестостерон по механизму обратной связи контролирует синтез ЛГ; рост и развитие фолликулов
-
ЛГ - стимулирует синтез эстрогена и прогестерона; синтез тестостерона
Оплодотворение – это слияние мужской и женской половых клеток с образованием одноклеточного зародыша – зиготы с диплоидным набором хромосом.
Схема последовательных этапов процесса оплодотворения
-
дистантное взаимодействие- встреча гамет в половых путях женщины
-
контактное взаимодействие
-
проникновение сперматозоида в яйцеклетку с последующими в ней изменениями - пенетрация
Фазы оплодотворения:
-
1. Дистантное взаимодействие — сближение сперматозоидов с яйцеклеткой под действием веществ, выделяемых яйцеклеткой.
-
2. Контактное взаимодействие — происходит акросомальная реакция сперматозоида, при которой высвобождаются ферменты из акросомы и разрушают небольшой участок блестящей оболочки.
-
3. Проникновение головки и шейки сперматозоида в ооплазму. В эту фазу происходит взаимодействие между рецепторами сперматозоида и яйцеклетки, после чего их мембраны сливаются, и головка и шейка сперматозоида оказываются в ооплазме. После проникновения одного сперматозоида в яйцеклетке возникает кортикальная реакция
Кортикальная реакция – препятствует полиспермии
В ооплазму входят ионы натрия, в результате чего меняется заряд цитомембраны яйцеклетки (с отрицательного на положительный). Кроме того, в ооплазме резко повышается концентрация ионов кальция. Все это приводит к тому, что кортикальные гранулы начинают двигаться к цитомембране яйцеклетки и их мембрана сливается с цитомембраной яйцеклетки, т.е. происходит экзоцитоз кортикальных гранул. Ферменты кортикальных гранул разрушают рецепторы для сперматозоидов и изменяют свойство блестящей оболочки, в результате чего другие сперматозоиды уже не могут проникнуть в ооплазму. Цитомембрана и блестящая оболочка яйцеклетки с видоизмененными свойствами получают название оболочки оплодотворения. После проникновения сперматозоида в яйцеклетку ядра этих клеток сначала располагаются по отдельности (стадия двух пронуклеусов), а потом сливаются (синкарион).
Нормальное оплодотворение, образование двух пронуклексов
Имплантация – внедрение зародыша в слизистую оболочку матки (начало на 7 сутки, заканчивается на 11-12 день)
-
Две стадии имплантации:
-
1- адгезия;
-
2- инвазия.
Гаструляция
Одновременно с процессом имплантации в зародыше человека начинается гаструляция. Это сложный процесс химических и морфогенетических изменений, сопровождающийся размножением, ростом, направленным движением дифференцировкой клеток, в результате чего образуется гаструла, содержащая три зародышевых листка – экто-, энто-, мезодерму.
Первая фаза гаструляции начинается на 7-е сутки эмбриогенеза и протекает одновременно с имплантацией. Осуществляется она путем деламинации. Эмбриобласт расщепляется на два зародышевых листка: эпибласт (первичная эктодерма) и гипобласт (первичная энтодерма). Клетки эпибласта служат источником развития всего зародыша и амниотической эктодермы. Клетки гипобласта перемещаются по внутренней поверхности трофобласта и участвуют в образовании стенки желточного мешка, которая плотно прилежит к трофобласту. На этом первая фаза гаструляции, которая протекает всю 2-ую нед развития.
Вторая фаза гаструляции – иммиграция - начинается на 14-15 день эмбрионального развития.
Основные процессы 2-ой фазы гаструляции протекают в эпибласте. Клетки эпибласта усиленно размножаются и перемещаются в краниокаудальном направлении (от переднего конца к заднему). У каудального конца зародыша 2 клеточных потока встречаются, поворачиваются и устремляются уже кпереди. В результате в центре эпибласта образуется скопление клеток, которое называется первичной полоской. Впереди от первичной полоски формируется первичный, или гензеновский, узелок.
Особенности гаструляции у человека
характерна гетерохронность дифференцировки клеточного материала эмбриональных зачатков - обособление эмбриональных зачатков происходит раньше. Зародышевые листки состоят не из однородного материала, а представляют собой сразу «мозаику» различных дифференцирующихся эмбриональных зачатков. Клеточный материал эмбриональных зачатков детерминируется на более ранних стадиях в период гаструляции, чем у млекопитающих. И в результате последующей специфической дифференцировки из них развиваются вполне определенные ткани и органы
Аномалии (врожденные пороки развития)
Тератология – раздел эмбриологии, изучающий нарушение строения эмбрионального развития, их причины и результаты
Аномалия – состояние, при котором орган или организм в целом выходит за рамки допускаемых представлений о возможных вариантах нормального
Как правило, это нарушения раннего эмбриогенеза
-
Нарушения структуры ткани, органа, части тела
-
«функциональные нарушения» – генетически обусловленные врожденные дефекты (энзимопатии – фенилкетонурия)
-
ВПР – 1:50 новорожденных
-
Частота конкретного ВПР – его отношение ко всей популяции: неопущение яичек 1:300; незаращение межпредсердной перегородки 1:5; расщепление губы и мягкого неба 1:1000; удвоение матки 1:1500
Классификация ВПР по механизму развития:
-
Нарушение развития – эмбриональный зачаток не возникает вообще или не развивается до необходимого (агенезия почки, влагалища)
-
Остановка развития – прекращение прогрессивного развития (двурогая матка, атрезия пищевода, др.)
-
Чрезмерный рост органа (гипертрихоз)
-
Слияние или расщепление органа (удвоение мочеточника, подковообразная почка)
-
Нарушение способности целого делиться (синдактилия)
-
Нарушение способности эмбрионального материала к атрофии, приводящее к персистенции временных структур (мембраны)
-
Нарушение единого целого в ходе формирования дефинитивных органов (добавочные органы)
-
Нарушение процессов миграции (неопущение яичек)
Причины ВПР
-
Внешнесредовые (химические, физические, биологические, экстремально-ситуационные)
-
Биологические (генетические, тератогенные, хромосомно-патогенные, онкогенные)
-
Социальные
20% ВПР – генные нарушения
10% - хромосомные абберации (нарушения организации хромосом)
10% - внутриутробные инфекции
60% - невыясненная этиология
Методы ВРТ (вспомогательных репродуктивных технологий)
это методы лечения бесплодия, при которых отдельные или все этапы зачатия и раннего развития эмбрионов осуществляются вне организма.
-
ЭКО (экстракорпоральное оплодотво-рение)
-
ИКСИ (инъекция сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки)
-
Донорство яйцеклеток
-
Суррогатное материнство
-
PGD(преимплантационная диагностика наследственных болезней эмбриона)
-
IVM (дозревание яйцеклетки вне организма
-
Замораживание ооцитов , спермы, эмбрионов, яичниковой ткани
-
Вспомогательный хетчинг
Основные лабораторные этапы программы in vitro оплодотворения ( ЭКО )
-
Пункция фолликулов под ультразвуковым контролем
-
Поиск и идентификация ооцит -кумулюсных комплексов
-
Контроль стадии зрелости ооцитов
-
Обработка спермы
-
Инсеминация ооцитов
-
Контроль оплодотворения
-
Культивирование и оценка морфологии эмбрионов
-
Выбор эмбрионов и перенос эмбрионов
Морфологическое исследование спермы (выявление сперматозоидов с аномалиями головки, шейки)
ИКСИ (ICSI)
Метод оплодотворения путем введения одного сперматозоида в яйцеклетку
PICSI
-
Новый метод селекции сперматозоидов PICSI
-
Селективный отбор сперматозоидов проводится на чашках PICSI перед процедурой ИКСИ с предшествующим определением на стеклах НВА.
-
Селекция сперматозоидов в программах ИКСИ – является ключевым моментом, определяющим влиянием мужской гаметы на доимплантационное развитие эмбрионов.
-
Использование данной методики в ИКСИ позволяет выбрать более функционально компетентные сперматозоиды, что позитивно влияет на вклад отцовской гаметы в доимплантационный эмбриогенез
Параметры оценки качества эмбрионов
-
Наличие фрагментации
-
Сферичность бластомеров
-
Равные размеры бластомеров
-
Аномалии зоны пелюцида
-
Аномалии цитоплазмы
-
Мультинуклеированные бластомеры
Вспомогательный хетчинг
Нанесение насечки в оболочке эмбриона для облегчения его выхода из оболочки оплодотворения и имплантации при в полость матки.
Оценка эмбрионов: дополнительные критерии
-
Генетические маркеры
-
PGS
-
анализ полярного тельца
-
митохондриальная ДНК
-
-
Морфокинетка
-
time-lapse например
-
-
Биохимические маркеры
-
аминокислотный профиль
-
инфракрасная спектроскопия
-
-
Дыхание
-
потребление кислорода
-
метаболизм пирувата/глюкозы
-
Технология серийной съемки позволяет выбрать один качественный эмбрион с максимальной возможностью к имплантации
Оценка эмбрионов: морфокинетика
-
Описывает большое количество параметров, потенциально характеризующих компетентность эмбриона
-
Выделяет важнейшие параметры, влияющие на результативность
-
Алгоритм EEVA позволяет оценить вероятность формирования бластоцисты
-
Значительно увеличивает шансы эмбриолога на выбор лучших эмбрионов
-
Сводит к минимуму различия в видении разных эмбриологов
-
Возможный путь увеличения ЧКБ
Нарушение имплантации
Привычное невынашивание беременности
-
Пренатальный генетический скрининг
-
CGH (Scott et al.,2012; Handyside et al., 2012)
-
Неэффективность FISH диагностики
-
-
MSOME + IMSI
-
Увеличение частоты наступления беременности в группе пациенток с повторным отсутствием имплантации (Bartoov , 2002, 2003, Cassuto 2009)
-
Снижение частоты преждевременных родов при использовании IMSI по сравнению со стандартным ИКСИ (Cassuto et al., 2012)
-
PICSI /Sperm Slow
-
Снижение числа прерываний беременности в группе пациентов с индексом зрелости сперматозоидов <65 (Worrilow et al., 2009)
-
Влияние на иммунное взаимодействие эмбриона и эндометрия
-
Ко-культивирование эмбриона и клеток эндометрия (Spandorfer et al., 2008)
-
Орошение полости матки ростовыми факторами перед переносом (Stamenow et al., 2011)
-
Использование метаболизированной среды при переносе эмбрионов
-
Использование клеток гранулёзы
-
Цитокины и доимплантационное развитие эмбриона
-
На протяжении всего процесса доимплантационного развития в репродуктивном тракте – от оплодотворения до имплантации – эмбрион подвергается воздействию цитокинов и ростовых факторов
Цитокины и ростовые факторы регулируют процессы выживания и пролиферации клеток
Роль факторов роста в наступлении и поддержании беременности
До имплантации
-
Регуляция процессов деления и дифференцировки клеток эмбриона
-
Регуляция взаимодейстивия бластоцисты с поверхностным эпителием и эндометрием
Во время имплантации
-
Обеспечение адгезии и пролиферации трофобласта
-
Обеспечение инвазии трофобласта
После имплантации
-
Обеспечение иммунной толерантности,
-
предотвращение отторжения плода
Влияние GM-CSF на развитие эмбриона
Увеличение общего числа клеток в бластоцисте
Увеличение числа клеток внутренней клеточной массы
Снижение уровня апоптоза (Robertson et al.,2001)
Экспрессия GM-CSF в репродуктивном тракте женщины
-
Экспрессия GM-CSF в период овуляции регулируется эстрогенами
-
Попадание семенной жидкости в репродуктивный тракт вызывает резкое увеличение уровня экспрессии GM-CSF и провоспалительных цитокинов клетками эндометрия
-
Второй пик экспрессии GM-CSF наблюдается в период имплантации
-
После имплантации GM-CSF экспрессируется в клетках трофобласта, децидуальной ткани и плаценты
GM-CSF и нарушения фертильности у женщин
-
Уровень экспрессии GM-CSF клетками эндометрия коррелирует с исходом цикла ЭКО (Spandorfer et al., 2008)
-
У женщин с бесплодием неясного генеза снижена концентрация GM-CSF в фолликулярной жидкости (Calogeroet et al.,2008)
-
В небольшой группе женщин с привычным невынашиванием беременности снижена экспрессия мРНК GM-CSF в эндометрии (Jasper et al., 2007)
IVM
Дозревание яйцеклеток вне женского организма
Особенности:
-
Поиск незрелых яйцеклеток
-
Этап дозревания яйцеклеток
-
Оплодотворение – ИКСИ
-
Проведение вспомогательного хетчинга
перед переносом эмбрионов
PGD
Особенности:
-
На 3 сутки у эмбриона забирается 1 бластомер для анализа
-
Фиксация, окраска и осмотр (FISH – анализ)
Показания:
-
Привычное невынашивание
-
Риск рождения ребенка с наследственными заболеваниями
Преимплантационная генетическая диагностика CGH
-
Метод сравнительной геномной гибридизации
-
Высокая точность выявления хромосомных патологий (числовые и структурные аномалии хромосом)
-
Исследование 23 пар хромосом
Криоконсервация эмбрионов
Позволяет сохранить их для использования в последующих менструальных циклах без проведения стимуляции яичников. Криоконсервированные эмбрионы могут храниться неограниченно долго.
Донорство спермы
Показания:
-
Отсутствие полового партнера
-
Отсутствие сперматозоидов у партнера
-
Тяжелые нарушения сперматогенеза
-
Неблагоприятный генетический прогноз потомства при использовании сперматозоидов партнера
-
Иммунный конфликт
Донорство яйцеклеток
Показания:
-
Отсутствие яичников
-
Истощение яичников
-
Неблагоприятный генетический прогноз потомства при использовании яйцеклеток супруги
Новые направления ВРТ
-
Криоконсервация ооцитов и яичниковой ткани для аутотрансплантации и реализации гормональной и репродуктивной функции женщины
-
ПГД клеток трофэктодермы и полярного тельца
-
Создание криобанка долгосрочного хранения спермы, ооцитов и донорских эмбрионов
-
Ко-культивирование эмбрионов на клетках эндометрия